Proefschrift ‘Aetiology of hypospadias: From genes to environment and back’

Dr. L. van der Zanden, Dr. ir. Nel Roeleveld, Dr. Barbara Franke en Dr. Iris A.L.M. van Rooij hebben 5 jaar lang promotieonderzoek gedaan naar de oorzaken van hypospadie.

Nederlandse samenvatting

Hypospadie is een veelvoorkomende aangeboren afwijking aan het mannelijke geslachtsorgaan, die bij 0.3 tot 0.7% van de jongens voorkomt. Bij hypospadie is de plasbuis verkeerd aangelegd, waardoor deze niet op de top van de penis uitkomt, maar aan de onderkant. Vaak zijn ook de huid, het onderliggende weefsel, en de corpora aangedaan. Hypospadie kent verschillende vormen, omdat de opening van de plasbuis in het glandulaire, peniele, penoscrotale, scrotale, of zelfs het perineale gebied kan uitkomen. In een klein percentage van de gevallen is er een monogene oorzaak, zoals een steroid-5-alpha-reductase type II deficiëntie of een gedeeltelijke androgeen ongevoeligheid door een androgeen receptor mutatie. Maar meestal kan de oorzaak van hypospadie niet achterhaald worden. Hoogstwaarschijnlijk is de etiologie in deze gevallen multifactorieel, wat betekent dat hypospadie door een combinatie van genen en omgevingsfactoren veroorzaakt wordt.

Hypospadie wordt door een combinatie van genen en omgevingsfactoren veroorzaakt

Het doel van het onderzoek beschreven in dit proefschrift was om meer kennis te verwerven over de genetische en omgevingsfactoren die bijdragen aan het ontstaan van hypospadie. We hadden hierbij de hypothese dat de verschillende vormen van hypospadie een andere oorzaak zouden kunnen hebben.

Deel 1: Inleiding en overzicht van de literatuur

Na een korte algemene inleiding in Hoofdstuk 1.1, bevat Hoofdstuk 1.2 een uitgebreide review van de literatuur over hypospadie. In deze review vatten we de huidige kennis over de etiologie van hypospadie samen, zowel ten aanzien van de genetische als de omgevingsfactoren.

Er zijn verschillende soorten studies gebruikt om de genetische factoren die betrokken zijn bij het ontstaan van hypospadie te identificeren. Bij het screenen van hypospadie patiënten op defecten in een enkel gen zijn mutaties geïdentificeerd in WT1, SF1, BMP4, BMP7, HOXA4, HOXB6, FGF8, FGFR2, AR, HSD3B2, SRD5A2, ATF3, MAMLD1, MID1 en BNC2. Verder zijn mutaties gevonden in CYP11A1, CYP17A1 en HSD17B3 in studies die een enkele patiënt beschrijven, terwijl associatie studies aantoonden dat polymorfismen in FGF8, FGFR2, AR, HSD17B3, SRD5A2, ESR1, ESR2, ATF3, MAMLD1, DGKK, MID1, CYP1A1, GSTM1 en GSTT1 het risico op hypospadie verhogen. Andere kandidaatgenen voor hypospadie zijn onder andere genen die syndromen veroorzaken waarbij vaak hypospadie voorkomt, zoals HOXA13, HOXD13, ZEB2 en EFNB2 en genen die hypospadie veroorzaken als ze gemuteerd zijn in diermodellen, zoals EphB2. Tenslotte hebben genexpressie studies CTGF, CYR61 en EGF geïdentificeerd als kandidaatgenen.

Veel onderzoek naar omgevingsfactoren die betrokken zouden kunnen zijn bij het ontstaan van hypospadie was gericht op hormoonverstorende stoffen die de potentie hebben te interfereren met de natuurlijke hormonen in het menselijk lichaam. Het feit dat deze stoffen hypospadie kunnen veroorzaken in diermodellen en dat er verschillende manieren zijn waarop deze stoffen het mannelijke voortplantingsstelsel kunnen beïnvloeden, suggereert dat deze stoffen hypospadie zouden kunnen veroorzaken in mensen, maar het is de vraag of de blootstellingsniveaus hoog genoeg zijn om dit effect teweeg te brengen. Aangezien zelfs sterke hormonale blootstellingen, zoals door hormoonstimulerende middelen om een zwangerschap te induceren of door pilgebruik tijdens de zwangerschap, geen consistente associatie met hypospadie laten zien, zouden exogene hormonen en hormoonverstorende stoffen minder belangrijk kunnen zijn in de etiologie van hypospadie dan tot nu toe aangenomen werd.

De consistente associatie van hypospadie met laag geboortegewicht, maternale hypertensie en preeclampsie suggereert dat placenta insufficiëntie een belangrijke risicofactor is voor hypospadie. Dit zou veroorzaakt kunnen worden doordat de foetus van onvoldoende humaan choriongonadotrofine (hCG) wordt voorzien. Onderzoek dat een associatie liet zien tussen hypospadie en een laag gewicht van de placenta of placenta-infarcten geeft direct bewijs voor een link tussen placenta insufficiëntie en hypospadie. Ook endogene hormonen zouden een rol kunnen spelen. Oestradiol niveaus zijn namelijk verhoogd bij een hoge maternale BMI, bij de eerste zwangerschap en bij meerlingzwangerschappen, terwijl deze factoren de kans op hypospadie verhogen.

Andere factoren die in de meeste studies een associatie lieten zien met hypospadie zijn maternale intra-uteriene blootstelling aan diethylstilbestrol (DES), vóór de zwangerschap aan- wezige diabetes, verlengde tijd tot zwangerschap, ICSI-geïnduceerde zwangerschap en gebruik van anti-epileptica vroeg in de zwangerschap. Mogelijk beschermende factoren, zoals maternaal gebruik van foliumzuur supplementen, en mogelijke andere risicofactoren, zoals maternale blootstelling aan bijproducten van waterzuivering, beroepsblootstellingen, gebruik van alcohol of medicijnen, roken, zwangerschapsdiabetes, IVF-geïnduceerde zwangerschap en leeftijd van de ouders waren niet of niet consistent geassocieerd met hypospadie.

Deel 2: Genetische studies

In het tweede deel van dit proefschrift hebben we ons gericht op genetische factoren die bij zouden kunnen dragen aan de etiologie van hypospadie. Hoofdstuk 2.1 beschrijft onze poging om de op dat moment belangrijkste genetische associaties gevonden voor hypospadie te repliceren. We hebben 4 SNPs (veranderingen in het DNA waarbij een nucleotide vervangen is door een ander nucleotide) gegenotypeerd in SRD5A2, ESR1, ESR2 en ATF3. Onze resultaten konden de associatie met de SNPs in SRD5A2, ESR2 en ATF3 niet bevestigen. De variant in ESR1 liet wel een associatie zien in dezelfde richting, maar veel minder sterk. Het verschil tussen onze studie en de eerdere studies zou veroorzaakt kunnen worden door verkeerde resultaten, door kansbevindingen, door het gebruik van verschillende criteria om de cases en controles te selecteren of door een echt verschil tussen de populaties. Omdat we hebben geprobeerd om incorrecte resultaten middels populatie-stratificatie te voorkomen door de cases en controles zorgvuldig te selecteren, een grote studiepopulatie hadden en vergelijkbare resultaten vonden voor de verschillende vormen van hypospadie, lijkt het erop dat er echte verschillen zouden kunnen zijn tussen de populaties. Dit kunnen verschillen zijn in de etiologie van hypospadie, doordat hypospadie in de ene populatie door andere genetische veranderingen veroorzaakt wordt dan in een andere populatie, verschillen in de omgevingsblootstellingen tussen populaties of verschillen in de genetische achtergrond. Deze kunnen de associaties beïnvloeden als deze associaties afhankelijk zijn van interacties met andere SNPs of van linkage disequilibrium (LD) met de oorzakelijke variant.

In Hoofdstuk 2.2 hebben we gekeken of het gebrek aan replicatie verklaard kon worden door verschillen in omgevingsblootstellingen tussen de populaties, door de aanwezigheid van gen- omgevingsinteracties te testen. We hebben twee interacties geïdentificeerd. De ene was een interactie tussen foetale blootstelling aan cytokines en de SNP in ATF3, die niet kon verklaren waarom wij andere resultaten vonden dan de eerdere studie. De andere was een interactie tussen exogene blootstelling aan oestrogenen en de SNP in SRD5A2. De SNP was alleen geassocieerd met hypospadie in blootgestelde cases. De studies die de associatie initieel gevonden hadden waren uitgevoerd in Chinese en Zweedse populaties, die meer blootgesteld worden aan fyto-oestrogenen door hogere consumptie van soyaproducten, roggebrood en bessen. De SNP veroorzaakt een verminderde enzymactiviteit en additionele oestrogeen- blootstelling kan een androgeen-oestrogeen disbalans veroorzaken in dragers van de variant, hetgeen kan resulteren in hypospadie. Omdat ook andere (epi)genetische processen betrokken kunnen zijn in de etiologie van hypospadie, hebben we onderzocht of het risico op hypospadie afhankelijk is van de ouder waar het allel vandaan komt of dat het beïnvloed wordt door het maternale genotype. We vonden geen associatie tussen het maternale genotype van de SNPs en het risico op hypospadie, maar we vonden wel dat de variant in ESR1 alleen het risico op hypospadie verhoogde als deze afkomstig was van de moeder. Dit suggereert dat het maternale allel van ESR1 sterker tot expressie komt dan het paternale allel in het zich ontwikkelende embryo.

Hoofdstuk 2.3 beschrijft de genoombrede associatie studie (GWAS) die we uitgevoerd hebben met gepooled DNA van hypospadie cases met een relatief kleine verplaatsing van de urethrale opening. Zeven van de 20 hoogst gerankte SNPs lagen in een X-chromosomaal gen dat codeert voor diacylglycerol kinase κ, DGKK. Individuele genotyperingen van twee SNPs in dit gen lieten zien dat ze sterk met hypospadie geassocieerd waren in de onderzoekspopulatie waarin het gen ontdekt was en in twee replicatie populaties, met odds ratio’s van 2.5. In een extra analyse van de SNPs in cases met een grotere verplaatsing van de urethrale opening vonden we een zwakkere associatie. Expressiestudies lieten zien dat DGKK tot expressie komt in de voorhuid van cases en controles en dat deze expressie lager is in dragers van het risico-allel van de sterkst geassocieerde SNP. Van de andere 9 hoog gerankte varianten die we in de individuele

samples gegenotypeerd hebben, lieten er 8 een associatie zien in de eerste onderzoeks- populatie, maar geen van deze associaties was statistisch significant in de replicatie populaties. In de meta-analyse vonden we associaties met de varianten in GRID1, KIAA2022, PPARGC1B en SLCO3A1, maar de associatie met de SNP in SLCO3A1 was minder significant in de meta-analyse dan in de eerste onderzoekspopulatie.

Deel 3: Omgevingsstudies

In de studies die beschreven worden in het derde deel van dit proefschrift, hadden we als doel meer te weten te komen over de omgevingsrisicofactoren die bijdragen aan de ontwikkeling van hypospadie. Hoofdstuk 3.1 beschrijft een patiëntcontrole onderzoek waarin we een breed scala aan risicofactoren bestudeerden. Laag geboortegewicht, twee- of drieling zwangerschappen, maternale preeclampsie of hypertensie, paternale subfertiliteit en het voorkomen van hypospadie in de familie waren geassocieerd met hypospadie. Deze bevindingen bevestigen de meeste eerdere studies. Verder werden de verhoogde risico’s die eerder gevonden werden voor diethylstilbestrol-dochters en IVF- of ICSI-geïnduceerde zwanger- schappen gerepliceerd, maar niet statistisch significant. Een nieuwe bevinding was de associatie met familiair voorkomen van testiskanker. Wat betreft familiair voorkomen van hypospadie werden hoge risicoschattingen gevonden voor de vormen van hypospadie met een kleine verplaatsing van de urethrale opening, maar niet voor de vormen met een grote verplaatsing. De associaties met laag geboortegewicht en preeclampsie leken juist veel sterker voor vormen van hypospadie met een grote verplaatsing. De meeste maternale factoren die onderzocht werden (bv. leeftijd, body mass index, beroepsblootstellingen, roken, gebruik van voorgeschreven medicijnen of orale anticonceptie, foliumzuursuppletie, een vegetarisch dieet en inname van soya, vis of schaaldieren) waren niet geassocieerd met hypospadie. Ook de meeste paternale factoren waren niet geassocieerd.

Laag geboortegewicht, twee- of drieling zwangerschappen, maternale preeclampsie of hypertensie, paternale subfertiliteit en het voorkomen van hypospadie in de familie waren geassocieerd met hypospadie

In Hoofdstuk 3.2 hebben we ons specifiek gericht op de risicofactoren voor de verschillende vormen van hypospadie. Weer vonden we een sterk verhoogd risico voor een familie- geschiedenis van hypospadie, vooral voor de vormen met een kleine verplaatsing van de urethrale opening. Maternale preeclampsie, primipariteit, vroeggeboorte, behoren tot een twee- of drieling of klein zijn voor de zwangerschapsduur waren geassocieerd met hypospadie in het algemeen, maar vooral met een grote verplaatsing van de urethrale opening. Het feit dat het gebruik van orale anticonceptie na de bevruchting ook sterker geassocieerd leek te zijn met deze vorm van hypospadie was een nieuwe bevinding. Onze studie liet een duidelijke etiologische heterogeniteit van hypospadie zien, waarbij genetische factoren een duidelijkere rol spelen in vormen met een kleine verplaatsing van de urethrale opening, terwijl de vormen met een grotere verplaatsing juist vooral geassocieerd zijn met zwangerschapsgerelateerde factoren.

Deel 4: Algemene discussie

In de algemene discussie (Hoofdstuk 4.1) gaan we in op verschillende methodologische aspecten, zoals de study designs en populaties die we gebruikt hebben, de methoden van dataverzameling, en de power van de studies. We vatten ook kort de conclusies samen die uit de studies die gepresenteerd worden in dit proefschrift getrokken kunnen worden. Verder geven we verschillende suggesties voor verder onderzoek, zoals exoom of whole-genome sequencing studies om nieuwe varianten die betrokken zijn bij het ontstaan van hypospadie te identificeren, gen-omgeving interactie analyses om het multifactoriële karakter van de aandoening te bestuderen of prospectieve studies om de oestrogene activiteit of de hCG niveaus in het maternale plasma te meten tijdens de zwangerschap. Verder kunnen gerichte resequencing pogingen de causale variant identificeren die ten grondslag ligt aan de associatie van de SNPs in DGKK met hypospadie, kunnen functionele studies naar DGKK in diermodellen helpen om de functie van het gen te achterhalen en kunnen in vitro technieken waarbij het genitale tuberkel van muizen gekweekt wordt bepalen of oestrogeenblootstelling SRD5A2 expressie kan beïnvloeden. Tot slot bespreken we de mogelijke klinische gevolgen van de identificatie van DGKK als een risicogen voor hypospadie en de mogelijkheden voor preventie.


Bij dit onderzoek zijn eveneens betrokken: Prof. dr. Nine V.A.M. Knoers en Prof. dr. Wout F.J. Feitz.